光——以及所有波——可以繞過沿其路徑發(fā)現(xiàn)的障礙物的角落。由于這種稱為衍射的現(xiàn)象，不可能將光聚焦到小于其波長一半的光點(diǎn)上。換句話說，理論上使用光學(xué)顯微鏡可以達(dá)到的最高分辨率約為 250 nm，這是一個(gè)稱為衍射極限的障礙。不幸的是，這種分辨率不足以觀察精細(xì)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，例如在神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。
一個(gè)多世紀(jì)以來，在超分辨率熒光顯微鏡發(fā)明之前，顯微鏡學(xué)家一直被這一經(jīng)典障礙所束縛。1990 年代后期開發(fā)了一種特別強(qiáng)大的方法，并創(chuàng)造了受激發(fā)射損耗 (STED) 顯微鏡。這種技術(shù)要求目標(biāo)樣品含有熒光團(tuán)，熒光團(tuán)是一種在一個(gè)波長處吸收光然后在更長的波長處重新發(fā)射的化合物。
在 STED 顯微鏡的最簡單版本中，通過衍射極限聚焦激光的照射，熒光團(tuán)在圓形光斑中被激發(fā)。然后，用能量較低的光(耗盡光束)照射光斑周圍的甜甜圈形部分，通過受激發(fā)射過程關(guān)閉熒光。因此，凈效應(yīng)是只有甜甜圈中心的熒光團(tuán)重新發(fā)射光子，而且由于該區(qū)域可以任意縮小，因此可以進(jìn)行超分辨率顯微鏡檢查。
盡管 STED 顯微鏡是在更高分辨率下觀察活神經(jīng)元形態(tài)的真正突破，但仍有改進(jìn)的空間。在最近發(fā)表在Neurophotonics 上的一項(xiàng)研究中，由波爾多大學(xué)的 U. Valentin Nägerl 博士領(lǐng)導(dǎo)的一組科學(xué)家開發(fā)了一種簡單而有效的校準(zhǔn)方法，可以在更高的組織深度進(jìn)行更精確的 STED 成像。他們的方法基于分析和校正生物樣品 STED 顯微鏡系統(tǒng)誤差的主要來源之一：耗盡光束的球面像差。
當(dāng)在高于 40 μm 的深度對組織樣本進(jìn)行成像時(shí)，耗盡光束會(huì)遭受各種類型的散焦和退化(像差)并失去其精心設(shè)計(jì)的形狀，這對于 STED 方法至關(guān)重要。球面像差是最大的問題，也是研究人員的目標(biāo)。他們的策略是首先準(zhǔn)備一個(gè)腦組織模型樣本，這是一種基于凝膠的代理，其折射率與實(shí)際大腦的折射率相似。這個(gè)體模樣本包含均勻分散的熒光團(tuán)和金納米粒子，這使團(tuán)隊(duì)能夠清楚地可視化和量化耗盡光束的形狀在穿透更深時(shí)如何變形。然后，他們根據(jù)組織深度計(jì)算了應(yīng)該對耗盡束進(jìn)行必要的預(yù)調(diào)整，以便其最終形狀更接近理想的形狀。
標(biāo)簽： 超分辨率顯微鏡
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