關于抗原抗體雜交法，抗原抗體雜交這個問題很多朋友還不知道，今天小六來為大家解答以上的問題，現(xiàn)在讓我們一起來看看吧！
1、抗原抗體雜交就是Western雜交，原理 Western雜交是將蛋白質(zhì)電泳、印跡、免疫測定融為一體的特異性蛋白質(zhì)的檢測方法。
2、其原理是：生物中含有一定量的目的蛋白。
3、先從生物細胞中提取總蛋白或目的蛋白，將蛋白質(zhì)樣品溶解于含有去污劑和還原劑的溶液中，經(jīng)SDS-PAGE電泳將蛋白質(zhì)按分子量大小分離，再把分離的各蛋白質(zhì)條帶原位轉(zhuǎn)移到固相膜（硝酸纖維素膜或尼龍膜）上，接著將膜浸泡在高濃度的蛋白質(zhì)溶液中溫育，以封閉其非特異性位點。
4、然后加入特異抗性體（一抗），膜上的目的蛋白（抗原）與一抗結合后，再加入能與一抗專一性結合的帶標記的二抗（通常一抗用兔來源的抗體時，二抗常用羊抗兔免疫球蛋白抗體），最后通過二抗上帶標記化合物（一般為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶）的特異性反應進行檢測。
5、根據(jù)檢測結果，從而可得知被檢生物（植物）細胞內(nèi)目的蛋白的表達與否、表達量及分子量等情況。
6、 Western 雜交技術是一種蛋白質(zhì)的固定和分析技術，是將已用聚丙烯酰胺凝膠或其它凝膠或電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維濾膜上，固定在濾膜上的蛋白質(zhì)成分仍保留抗原活性及與其它大分子特異性結合的能力，所以能與特異性抗體或核酸結合，其程序Southern Blot相似，故稱為Western Blot,第一抗體與膜上特異抗原結合后，再用標記的二抗(同位素或非同位素的酶)來檢測，此方法可檢測1ng抗原蛋白。
7、Western雜交方法靈敏度高，通?？蓮闹参锟偟鞍字袡z測出50ng的特異性的目的蛋白。
8、編輯本段試劑配制 (1)轉(zhuǎn)移電泳緩沖液：20mmol/L Tris HCL pH8.0 150mmol/L 甘氨酸 加14.5g Tris粉 67.08g甘氨酸于4L水中，加入1200mL 甲醇，加水至6L (2)麗春紅S溶液：0.5%麗春紅S 1%乙酸編輯本段操作步驟： (1)用已制備好的SDS-PAGE分離的蛋白凝膠。
9、 (2)用一張濾紙，剪成與膠同樣大小，在轉(zhuǎn)移電泳緩沖液中預濕，放在Scotch-Brit Pad上，在膠的陰性端放上濾紙，膠的表面用該緩沖液浸濕，排出所有氣泡。
10、 (3)在膠的陽極面放置同樣大小浸濕的硝酸纖維素膜，排出氣泡，再在濾膜的陽極端放置一張濾紙，排出氣泡，再放一個Scotch-Brit Pad。
11、 (4)將以上“三明治”樣裝置放入一個塑料支撐物中間，將支撐物放入電轉(zhuǎn)移裝置中，加入電轉(zhuǎn)移緩沖液。
12、 (5)接通電源：使膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，電壓為14V 4℃轉(zhuǎn)移4小時或過夜。
13、 (6)將濾膜放入麗春紅S溶液中5分鐘，蛋白染色水中脫色2分鐘，照像，用印度墨水將分子量標準染色，在水中完全脫色。
14、 (7)將濾膜放在塑料袋中，每3張加入5mL封閉緩沖液(1克速溶去脂奶粉溶于100ml PBS中)，封閉特異性抗體結合位點，室溫1h，搖動，倒出封閉緩沖液。
15、 (8)在封閉緩沖液中稀釋第一抗體，加入后室溫放置1小時，將濾膜轉(zhuǎn)到塑料盒中，用200mL PBS洗四次，搖動。
16、 (9)在封閉緩沖液中稀釋辣根過氧化物酶標記的二抗，重復步驟8。
17、 (10)將濾膜放在100mL新配制的DAB底物溶液中，大約2～3分鐘就可顯色，用水沖洗終止反應、照像。
18、 結果分析：分析陽性(顯色)條帶的分子量大小，而且根據(jù)信號(顏色)強弱分析蛋白表達量。
本文分享完畢，希望對大家有所幫助。
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