抗原抗體雜交技術(shù)的作用（抗原抗體雜交）

關(guān)于抗原抗體雜交技術(shù)的作用，抗原抗體雜交這個(gè)問(wèn)題很多朋友還不知道，今天小六來(lái)為大家解答以上的問(wèn)題，現(xiàn)在讓我們一起來(lái)看看吧！

1、抗原抗體雜交就是Western雜交，原理　　Western雜交是將蛋白質(zhì)電泳、印跡、免疫測(cè)定融為一體的特異性蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法。

2、其原理是：生物中含有一定量的目的蛋白。

3、先從生物細(xì)胞中提取總蛋白或目的蛋白，將蛋白質(zhì)樣品溶解于含有去污劑和還原劑的溶液中，經(jīng)SDS-PAGE電泳將蛋白質(zhì)按分子量大小分離，再把分離的各蛋白質(zhì)條帶原位轉(zhuǎn)移到固相膜（硝酸纖維素膜或尼龍膜）上，接著將膜浸泡在高濃度的蛋白質(zhì)溶液中溫育，以封閉其非特異性位點(diǎn)。

4、然后加入特異抗性體（一抗），膜上的目的蛋白（抗原）與一抗結(jié)合后，再加入能與一抗專(zhuān)一性結(jié)合的帶標(biāo)記的二抗（通常一抗用兔來(lái)源的抗體時(shí)，二抗常用羊抗兔免疫球蛋白抗體），最后通過(guò)二抗上帶標(biāo)記化合物（一般為辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶）的特異性反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)。

5、根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，從而可得知被檢生物（植物）細(xì)胞內(nèi)目的蛋白的表達(dá)與否、表達(dá)量及分子量等情況。

6、 　　Western 雜交技術(shù)是一種蛋白質(zhì)的固定和分析技術(shù)，是將已用聚丙烯酰胺凝膠或其它凝膠或電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維濾膜上，固定在濾膜上的蛋白質(zhì)成分仍保留抗原活性及與其它大分子特異性結(jié)合的能力，所以能與特異性抗體或核酸結(jié)合，其程序Southern Blot相似，故稱(chēng)為Western Blot,第一抗體與膜上特異抗原結(jié)合后，再用標(biāo)記的二抗(同位素或非同位素的酶)來(lái)檢測(cè)，此方法可檢測(cè)1ng抗原蛋白。

7、Western雜交方法靈敏度高，通?？蓮闹参锟偟鞍字袡z測(cè)出50ng的特異性的目的蛋白。

8、編輯本段試劑配制　　(1)轉(zhuǎn)移電泳緩沖液：20mmol/L Tris HCL pH8.0 　　150mmol/L 甘氨酸 　　加14.5g Tris粉 67.08g甘氨酸于4L水中，加入1200mL 　　甲醇，加水至6L 　　(2)麗春紅S溶液：0.5%麗春紅S 　　1%乙酸編輯本段操作步驟：　　(1)用已制備好的SDS-PAGE分離的蛋白凝膠。

9、 　　(2)用一張濾紙，剪成與膠同樣大小，在轉(zhuǎn)移電泳緩沖液中預(yù)濕，放在Scotch-Brit Pad上，在膠的陰性端放上濾紙，膠的表面用該緩沖液浸濕，排出所有氣泡。

10、 　　(3)在膠的陽(yáng)極面放置同樣大小浸濕的硝酸纖維素膜，排出氣泡，再在濾膜的陽(yáng)極端放置一張濾紙，排出氣泡，再放一個(gè)Scotch-Brit Pad。

11、 　　(4)將以上“三明治”樣裝置放入一個(gè)塑料支撐物中間，將支撐物放入電轉(zhuǎn)移裝置中，加入電轉(zhuǎn)移緩沖液。

12、 　　(5)接通電源：使膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，電壓為14V 4℃轉(zhuǎn)移4小時(shí)或過(guò)夜。

13、 　　(6)將濾膜放入麗春紅S溶液中5分鐘，蛋白染色水中脫色2分鐘，照像，用印度墨水將分子量標(biāo)準(zhǔn)染色，在水中完全脫色。

14、 　　(7)將濾膜放在塑料袋中，每3張加入5mL封閉緩沖液(1克速溶去脂奶粉溶于100ml PBS中)，封閉特異性抗體結(jié)合位點(diǎn)，室溫1h，搖動(dòng)，倒出封閉緩沖液。

15、 　　(8)在封閉緩沖液中稀釋第一抗體，加入后室溫放置1小時(shí)，將濾膜轉(zhuǎn)到塑料盒中，用200mL PBS洗四次，搖動(dòng)。

16、 　　(9)在封閉緩沖液中稀釋辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，重復(fù)步驟8。

17、 　　(10)將濾膜放在100mL新配制的DAB底物溶液中，大約2～3分鐘就可顯色，用水沖洗終止反應(yīng)、照像。

18、 　　結(jié)果分析：分析陽(yáng)性(顯色)條帶的分子量大小，而且根據(jù)信號(hào)(顏色)強(qiáng)弱分析蛋白表達(dá)量。

本文分享完畢，希望對(duì)大家有所幫助。

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