2021年8 月 18 日——科學家們使用牛津納米孔技術公司 (ONT) 的長讀長測序平臺開發(fā)了一種新的實驗室協(xié)議和生物信息學管道，用于探索環(huán)狀 RNA (circRNA) 的組成。該技術于 8 月 10 日發(fā)表在Nature Communications 上，表明在 circRNA 中優(yōu)先發(fā)現(xiàn)了一組微外顯子——小于 30 個核苷酸的外顯子——以前與自閉癥有關。
CircRNA 是一種單鏈 RNA，與線性 RNA 不同，它形成共價閉合的連續(xù)環(huán)。此外，circRNA 是非編碼的，但仍然在各種細胞過程中發(fā)揮功能作用。
RNA中只有一小部分是circRNA(約1%)，科學家們對circRNA生物學的了解還很有限，包括它的生物起源、調控表達以及在哺乳動物細胞中的功能。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，circRNA 似乎與大腦發(fā)育和炎癥有關，并且已知它們可作為癌癥的生物標志物。一種特殊的 circRNA，ciRS-7/CDR1-AS，已被證明在從小鼠大腦中取出時會引起認知變化。
理解 circRNA 組成的挑戰(zhàn)之一是，到目前為止，只能使用讀取短片段 RNA 的測序技術來描述 circRNA，這是當前技術狀態(tài)所施加的限制。
相比之下，新方法提供了一種對 circDNA 進行長讀長測序的方法。研究人員應用牛津納米孔平臺的長讀長測序技術來描述人和小鼠腦組織樣本中全長circRNA的外顯子(基因的編碼部分)組成，以及相應的mRNA。
為了將 circRNA 歸零，該小組由丹麥奧爾胡斯大學分子生物學和遺傳學系的 Karim Rahimi 博士領導，進行了一項富集方案，其中用 RiboZero 處理小鼠或人腦組織樣本的總 RNA，以去除核糖體 RNA 并使用 RNase R 去除線性 RNA。執(zhí)行額外的聚腺苷酸化步驟，然后去除聚 (A)，以確保去除所有線性 RNA。
接下來，研究人員在長讀長測序(circNick-LRS)之前對富含 circRNA 的池應用“溫和”水解，然后進行 3' 末端多聚腺苷酸化以與標準 ONT 協(xié)議保持一致。
在使用 circNick-LRS 進行長讀長測序后，研究人員能夠表征人腦中的 18,266 個 circRNA 和小鼠大腦中的 39,623 個。相比之下，短讀長測序檢測到 3,740 個人類 circRNA 和 5,299 個小鼠 circRNA。
在 circNick-LRS 檢測到的 circRNA 中，在人和小鼠腦樣本中均發(fā)現(xiàn)了 5,537 個，分別占檢測到的人和小鼠 circRNA 的 30.3% 和 14%。這組作者說，這與之前的研究相當，表明該方法在檢測 circRNA 方面是可靠的。
測序結果表明，circRNA與線性RNA不同，表現(xiàn)出大量剪接事件，如新外顯子、內含子保留和微外顯子。作者推測，circRNA 中的微外顯子可以作為蛋白質或微 RNA 的轉錄調節(jié)因子或結合位點。
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