2021年8 月 18 日——科學(xué)家們使用牛津納米孔技術(shù)公司 (ONT) 的長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序平臺(tái)開(kāi)發(fā)了一種新的實(shí)驗(yàn)室協(xié)議和生物信息學(xué)管道，用于探索環(huán)狀 RNA (circRNA) 的組成。該技術(shù)于 8 月 10 日發(fā)表在Nature Communications 上，表明在 circRNA 中優(yōu)先發(fā)現(xiàn)了一組微外顯子——小于 30 個(gè)核苷酸的外顯子——以前與自閉癥有關(guān)。
CircRNA 是一種單鏈 RNA，與線性 RNA 不同，它形成共價(jià)閉合的連續(xù)環(huán)。此外，circRNA 是非編碼的，但仍然在各種細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮功能作用。
RNA中只有一小部分是circRNA(約1%)，科學(xué)家們對(duì)circRNA生物學(xué)的了解還很有限，包括它的生物起源、調(diào)控表達(dá)以及在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的功能。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，circRNA 似乎與大腦發(fā)育和炎癥有關(guān)，并且已知它們可作為癌癥的生物標(biāo)志物。一種特殊的 circRNA，ciRS-7/CDR1-AS，已被證明在從小鼠大腦中取出時(shí)會(huì)引起認(rèn)知變化。
理解 circRNA 組成的挑戰(zhàn)之一是，到目前為止，只能使用讀取短片段 RNA 的測(cè)序技術(shù)來(lái)描述 circRNA，這是當(dāng)前技術(shù)狀態(tài)所施加的限制。
相比之下，新方法提供了一種對(duì) circDNA 進(jìn)行長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序的方法。研究人員應(yīng)用牛津納米孔平臺(tái)的長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)來(lái)描述人和小鼠腦組織樣本中全長(zhǎng)circRNA的外顯子(基因的編碼部分)組成，以及相應(yīng)的mRNA。
為了將 circRNA 歸零，該小組由丹麥奧爾胡斯大學(xué)分子生物學(xué)和遺傳學(xué)系的 Karim Rahimi 博士領(lǐng)導(dǎo)，進(jìn)行了一項(xiàng)富集方案，其中用 RiboZero 處理小鼠或人腦組織樣本的總 RNA，以去除核糖體 RNA 并使用 RNase R 去除線性 RNA。執(zhí)行額外的聚腺苷酸化步驟，然后去除聚 (A)，以確保去除所有線性 RNA。
接下來(lái)，研究人員在長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序(circNick-LRS)之前對(duì)富含 circRNA 的池應(yīng)用“溫和”水解，然后進(jìn)行 3' 末端多聚腺苷酸化以與標(biāo)準(zhǔn) ONT 協(xié)議保持一致。
在使用 circNick-LRS 進(jìn)行長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序后，研究人員能夠表征人腦中的 18,266 個(gè) circRNA 和小鼠大腦中的 39,623 個(gè)。相比之下，短讀長(zhǎng)測(cè)序檢測(cè)到 3,740 個(gè)人類(lèi) circRNA 和 5,299 個(gè)小鼠 circRNA。
在 circNick-LRS 檢測(cè)到的 circRNA 中，在人和小鼠腦樣本中均發(fā)現(xiàn)了 5,537 個(gè)，分別占檢測(cè)到的人和小鼠 circRNA 的 30.3% 和 14%。這組作者說(shuō)，這與之前的研究相當(dāng)，表明該方法在檢測(cè) circRNA 方面是可靠的。
測(cè)序結(jié)果表明，circRNA與線性RNA不同，表現(xiàn)出大量剪接事件，如新外顯子、內(nèi)含子保留和微外顯子。作者推測(cè)，circRNA 中的微外顯子可以作為蛋白質(zhì)或微 RNA 的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子或結(jié)合位點(diǎn)。
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