如何構(gòu)建基因過表達(dá)載體

關(guān)于如何構(gòu)建基因過表達(dá)載體這個(gè)問題很多朋友還不知道，今天小六來為大家解答以上的問題，現(xiàn)在讓我們一起來看看吧！

1、當(dāng)拿到一個(gè)基因的DNA片段后，就需要把它導(dǎo)入一個(gè)載體，一方面長期保存。

2、另一方面也需要以載體為媒介將基因?qū)胧荏w細(xì)胞中。

3、基因表達(dá)載體的構(gòu)建是基因工程的核心。

4、常用的載體有細(xì)菌質(zhì)粒，噬菌體和動(dòng)植物病毒。

5、其中質(zhì)粒載體最常用。

6、所謂載就是一個(gè)很長的環(huán)狀DNA，攜帶一些基因，可以導(dǎo)入細(xì)菌中自我復(fù)制，也可以從細(xì)菌中提取出來改造。

7、現(xiàn)在我們就需要把SUN片段連到一個(gè)載體，用VectorNTI打開，研究一下用哪個(gè)酶處理，這個(gè)載體需要用Sma1這個(gè)酶切開，然后用SUN連上，替換切下來的ccdb，這里要用到兩個(gè)酶，一個(gè)Sma1限制性內(nèi)切酶切開，一個(gè)DNA連接酶把新片段連上，植物轉(zhuǎn)基因載體和這些酶都是非常常用的試劑。

8、載體構(gòu)建好之后需要把它們導(dǎo)入大腸桿菌中復(fù)制，這里就要用到大腸桿菌的感受態(tài)了，十把構(gòu)建好的載體和感受態(tài)混合，然后放到42度熱水處理個(gè)1分鐘，再冰上放個(gè)3分鐘。

9、這時(shí)需要一些培養(yǎng)細(xì)菌的培養(yǎng)基來培養(yǎng)菌們，大腸桿菌這種菌很好養(yǎng)活，唯一需要注意的是，滅菌過后的培養(yǎng)基要小心保存。

10、把在冰上處理過的大腸桿菌放到培養(yǎng)基中培養(yǎng)一天，為了防止沒有轉(zhuǎn)入載體的菌也混進(jìn)來，我們?cè)谳d體上加入了一個(gè)抵抗抗生素的基因。

11、這樣我們?cè)谂囵B(yǎng)基中加入這種抗生素，在里面就只有需要的大腸桿菌能生長了。

12、最后得到了上億個(gè)攜帶著含有我們的SUN基因的載體的大腸桿菌，這時(shí)就需要把質(zhì)粒再提出來。

13、實(shí)驗(yàn)室里提質(zhì)粒需要用專門的試劑盒，也可以簡(jiǎn)化一下，先把菌液離心讓菌沉淀，然后再用水把菌打散，然后煮沸1分鐘再離心，取上清，上清中加乙醇讓DNA析出，再離心讓DNA沉淀，最后用水把DNA溶解。

14、這樣提出來的DNA會(huì)有很多雜質(zhì)以及細(xì)菌的基因組DNA。

15、擴(kuò)展資料：目的基因與運(yùn)載體結(jié)合：將目的基因與運(yùn)載體結(jié)合的過程，實(shí)際上是不同來源的DNA重新組合的過程。

16、如果以質(zhì)粒作為運(yùn)載體，要用一定的限制酶切割質(zhì)粒，使質(zhì)粒出現(xiàn)一個(gè)缺口，露出黏性末端。

17、然后用同一種限制酶切斷目的基因，使其產(chǎn)生相同的黏性末端（部分限制性內(nèi)切酶可切割出平末端，擁有相同效果）。

18、將切下的目的基因的片段插入質(zhì)粒的切口處。

19、首先堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，兩個(gè)黏性末端吻合在一起，堿基之間形成氫鍵，再加入適量DNA連接酶，催化兩條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵，從而將相鄰的脫氧核糖核酸連接起來。

20、形成一個(gè)重組DNA分子。

21、如人的胰島素基因就是通過這種方法與大腸桿菌中的質(zhì)粒DNA分子結(jié)合，形成重組DNA分子（也叫重組質(zhì)粒）的。

22、參考資料來源：百度百科-基因表達(dá)載體。

本文分享完畢，希望對(duì)大家有所幫助。

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