表觀遺傳化學(xué)探針在非腫瘤學(xué)研究中的應(yīng)用

干細(xì)胞分化

人們?cè)絹?lái)越意識(shí)到表觀遺傳調(diào)節(jié)在干細(xì)胞編程中的重要性。以下是使用表觀遺傳探針進(jìn)行的干細(xì)胞研究的一些示例。Lee 等人 [PMID：27625395] 將 miR-221 基因編碼的 miR-221-3p 和 miR-221-5p 作為潛在的抗干細(xì)胞性 miRNA。在一項(xiàng)由Chen 等人進(jìn)行的隨后研究中， PRMT7 介導(dǎo)的 microRNA-24-2 下調(diào)能維持小鼠胚胎干細(xì)胞 (mESC) 中的 Oct4、Nanog 和 Sox2 [PMID: 29378844]。通過(guò)一項(xiàng)報(bào)告基因分析和多項(xiàng)突變研究，Chen 等人發(fā)現(xiàn) miR-221 能靶向 Oct4、Nanog、SOX2、Klf4 和 PRMT7 的 3’UTR。CRISPR 介導(dǎo)的 miR-221 基因刪除以及 miR-221-3p 和 miR-221-5p 的特定反義抑制劑抑制了 PRMT7 缺失型小鼠 ESC 的自發(fā)分化。此外，當(dāng) PRMT7 缺失時(shí)，miR-221 啟動(dòng)子處的抑制性標(biāo)記 H4R3me1 和 H4R3me2 也減少(使用兩種不同的 shRNA)。

骨骼肌重塑

已使用表觀遺傳化學(xué)探針來(lái)研究骨骼肌重塑，結(jié)果表明 PRMT1 不僅參與成肌細(xì)胞分化，還參與線粒體合成和代謝。Shen 等人研究了 PRMT1、PRMT4 和 PRMT5 在 7 天肌生成期間內(nèi)的基因和蛋白表達(dá) [PMID：29208765]。通過(guò)已建立的組織學(xué)和分子標(biāo)記物法成肌，作者首次證實(shí)，正如預(yù)期的一樣，C2C12 細(xì)胞在 7 天時(shí)間內(nèi)從單核成肌細(xì)胞發(fā)展成強(qiáng)健的肌管細(xì)胞。作者發(fā)現(xiàn)PRMT1 mRNA 會(huì)顯著增加(在第 5 天達(dá)到峰值)，而 PRMT4 和 PRMT5 轉(zhuǎn)錄水平則保持不變。此外，蛋白表達(dá)與轉(zhuǎn)錄水平相符。在這段時(shí)間內(nèi)，PRMT4 和 PRMT5 的表達(dá)平穩(wěn)無(wú)變化，而 PRMT1 的表達(dá)在肌生成的第 3 天至少翻了兩倍，且持續(xù)增加，直到第 7 天。

Shen 等人還檢測(cè)了總體的單甲基精氨酸 (MMA)、非對(duì)稱(chēng)和對(duì)稱(chēng)二甲基精氨酸(ADMA 和 SDMA)以及特定組蛋白底物的甲基化。ADMA 在第 3 天增加了 1.7 倍，且持續(xù)增加，而 MMA 和 SDMA 則保持不變。在第 7 天，與成肌細(xì)胞相比，PRMT1 底物 H4R3me2a 和 H3R17me2a 高出約 2 倍，而 H3R8me2s 狀態(tài)則保持不變。使用 0.1 μM 的 TC-E 對(duì) PRMT1 進(jìn)行化學(xué)抑制不會(huì)影響細(xì)胞 H4，但會(huì)使 H4R3me2a 的水平下降 25%，以及降低所有與第 3-7 天肌生成相關(guān)的形態(tài)學(xué)指標(biāo)。在這段時(shí)間內(nèi)，線粒體電子傳遞鏈 CI、CIII、CV 和 PGC-1α 減少了約 20-40%，而 CII 則保持不變。最終，相對(duì)于載體對(duì)照，在有抑制劑的情況下，第 3-7 天的耗氧量減少了 20-35%。

破骨細(xì)胞和骨重塑

破骨細(xì)胞 (OC) 在骨重塑、修復(fù)和礦物質(zhì)維持中起著重要作用。在 RANKL 誘導(dǎo)的 RAW264.7 巨噬細(xì)胞的 OC 分化期間，DOT1L 表達(dá)和隨后的 H3K79 甲基化增加 [PMID：29348610]。相對(duì)于 RAW264.7，使用 EPZ 004777 或 EPZ5676 對(duì) DOT1L 進(jìn)行化學(xué)抑制會(huì)導(dǎo)致 RAW264.7 衍生的 OC 中的 H3K79me2 整體減少。在 RAW264.7 細(xì)胞中，有證據(jù)顯示 H3K27 和 H3K36 甲基化實(shí)際上會(huì)增加，而在 OC 中，僅 H3K36 甲基化會(huì)輕微增加。此外，自噬相關(guān)蛋白 SNARE、Sqstm1、VPS35 和 Atg3 在 40 小時(shí)的 OC 前細(xì)胞中被上調(diào);一項(xiàng)商業(yè)檢測(cè)和針對(duì)自噬體標(biāo)志物的蛋白印跡實(shí)驗(yàn)確實(shí)證實(shí)了自噬活性會(huì)增加。

在一項(xiàng)相關(guān)研究中，Kota 等人 [PMID：30189247] 通過(guò)在穩(wěn)態(tài)下處理間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞系或用 EPZ015666 (0.6-1.4 μM) 進(jìn)行成骨分化來(lái)抑制 PRMT5。對(duì)PRMT5 的抑制會(huì)增強(qiáng)成骨細(xì)胞分化和下調(diào)數(shù)種 Gbp(鳥(niǎo)苷酸結(jié)合蛋白)家族基因。這會(huì)導(dǎo)致干擾素刺激基因位點(diǎn)啟動(dòng)子處的 H3R8me2 和 H4R3me2 出現(xiàn)總體下降以及啟動(dòng)子特異性下降。

人體骨骼的強(qiáng)度和完整性取決于破骨細(xì)胞骨吸收和成骨細(xì)胞骨形成之間的微妙平衡。BRPF 支架蛋白經(jīng)證實(shí)會(huì)抑制破骨細(xì)胞生成轉(zhuǎn)錄所需的程序，從而參與 RANKL 誘導(dǎo)的原代小鼠骨髓細(xì)胞和人體原代單核細(xì)胞分化成骨吸收破骨細(xì)胞的過(guò)程 [PMID：28849908]。

心臟祖細(xì)胞分化

DOT1L 還在心臟祖細(xì)胞的分化中起著重要作用 [PMID：29631608]。在 hESC 分化成心臟祖細(xì)胞和心肌細(xì)胞期間，ChIP 檢測(cè)到 GATA4、HAND1、NR2F2、NKX2.5、MESP1、ISL1 和 WNT5A 上有 DOT1L 特異性標(biāo)記 H3K79me2。KIND1 和 HES3 分化表明 DOT1L 與主要心臟轉(zhuǎn)錄因子 NKX2.5 共定位(在多能性階段之后以及在分化成心臟祖細(xì)胞和心肌細(xì)胞期間)。對(duì) DOT1L 進(jìn)行 siRNA 敲減不會(huì)影響 hES 的多能性，但會(huì)影響分化成為心臟細(xì)胞系。這在形態(tài)學(xué)上以及在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平下得到證實(shí)。作者確認(rèn)，DOT1L 可能與其他組蛋白修飾酶共同發(fā)揮作用，因?yàn)?H3K4me3 和 H3K36me3 經(jīng)證實(shí)還參與了心臟祖細(xì)胞的分化。

炎癥中的表觀遺傳學(xué)

炎癥機(jī)制失調(diào)有害，且是哮喘、關(guān)節(jié)炎、銀屑病、過(guò)敏性濕疹、牙周炎和炎性腸病等常見(jiàn)慢性病的根本原因。下文總結(jié)了數(shù)篇在炎癥相關(guān)研究中使用化學(xué)探針的近期文獻(xiàn)。

BET 抑制劑在各種炎癥模型中均顯示具有積極作用。由于現(xiàn)有的 BET 拮抗劑無(wú)法區(qū)分不同的 BET 家族成員，因此許多研究都無(wú)法提供關(guān)于 BRD4 相對(duì)于 BRD2 或 BRD3 的生物功能的明確結(jié)果。近期出版物包括一項(xiàng)體內(nèi)研究，在該研究中，BET 溴區(qū)結(jié)構(gòu)域抑制劑 JQ1 減少了由脊髓損傷引起的急性炎癥 [PMID：30134146]。由 GSK4027 相關(guān) PROTAC 引起的 PCAF/GCN5 降解(而非 GSK4027 引起的拮抗)表明，其在單核細(xì)胞分化成巨噬細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞的過(guò)程中發(fā)揮作用 [PMID：30200762]。

PRMT 和 PKMT 還在炎性反應(yīng)中起作用。PRMT1、PRMT4、PRMT5 和 PRMT6 在癌癥及其轉(zhuǎn)移相關(guān)的炎癥、哮喘和抗原誘導(dǎo)的肺氣道疾病、對(duì)感染的反應(yīng)、移植排斥、糖尿病和炎性腸病中都起著不同的作用 [PMID：27860244、28087667、29119338、27840030、27860244 和 29973649]。DOT1L、PRC2 復(fù)合體、G9a 和 SMYD3 等 PKMT 通過(guò) DOT1L 抑制劑 EPZ5676 和 SGC0946 參與先天免疫應(yīng)答 [PMID：30275539、29765028]、及用 EZH2 抑制劑 UNC1999 和 GSK503 進(jìn)行 T 細(xì)胞抗原受體 (TCR) 介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) [PMID：29523590]、通過(guò) G9a 基因敲除來(lái)調(diào)節(jié)炎癥的肝臟特異性基因 [PMID：29912608]，還參與調(diào)節(jié)肺部病毒感染期間的致病性 T 細(xì)胞應(yīng)答 [PMID：25669152]。

病毒研究表觀遺傳學(xué)

流感病毒的 RNA 會(huì)與其核蛋白 (NP) 發(fā)生相互作用，其核蛋白的功能與真核細(xì)胞中的組蛋白相似。Hatakeyama 等人發(fā)表的一篇出版物 [PMID：29555684] 通過(guò)兩種宿主細(xì)胞乙?；D(zhuǎn)移酶 PCAF 和 GCN5 分別在 K31 和 K90 處來(lái)鑒別病毒 NP 乙?；?。靶向 PCAF 和 GCN5 的 siRNA 不會(huì)影響 NP 乙?；剑珪?huì)對(duì)病毒的轉(zhuǎn)錄活性產(chǎn)生相反作用，且 PCAF 特異性 siRNA 會(huì)增加病毒轉(zhuǎn)錄。K31 和 K90 位于 RNA 結(jié)合溝的對(duì)面。這兩個(gè)事實(shí)表明，K90 的 GCN5 乙?；纳镒饔门c K31 的 PCAF 乙?；煌８鶕?jù)先前的 NP 相互作用研究，作者進(jìn)一步表明 SMARCA2 和 SMARCA4 對(duì)乙酰賴(lài)氨酸結(jié)合域的作用。

Marcos-Villar 等人的相關(guān)研究報(bào)告了在流感感染期間能更全面地了解 DNA 和組蛋白水平 [PMID：29352168]。DNA 甲基化未受影響，但組蛋白 H3 和 H4 甲基化水平 H3K4me3 則降低，而 H3K36 (me0)、H4K20me2 和 H3K79me2 則增加。這些變化與轉(zhuǎn)錄失活有關(guān)。DOT1L 抑制劑(用量為 1 微摩爾)或(特異性)shRNA 均會(huì)降低 H3K79me2 和增加流感病毒的復(fù)制。一項(xiàng)更詳細(xì)的針對(duì)發(fā)生流感感染后 DOT1L 的作用的研究表明，DOT1L 下調(diào)會(huì)導(dǎo)致 NF-κB 復(fù)合體核轉(zhuǎn)位減少以及 IFNβ 和 ISG(Mx1 和 ISG56)的表達(dá)降低。此外，DOT1L 抑制不會(huì)影響缺乏 IFN 通路的流感感染細(xì)胞。

代謝疾病表觀遺傳學(xué)

維生素 D 受體

對(duì)源自人體 iPS 細(xì)胞的 β 樣細(xì)胞進(jìn)行了一次無(wú)偏倚 CRISPR 篩查，且隨后的基因本體論 (GO) 分析確認(rèn)了與染色質(zhì)修飾、細(xì)胞周期和轉(zhuǎn)錄相關(guān)的基因 [PMID：29754817]。維生素 D 受體 (VDR) 是最富集的基因靶標(biāo)之一(7 個(gè) sgRNA 中有 6 個(gè)在 GFP 細(xì)胞中發(fā)現(xiàn))。包含 shRNA 敲減 VDR 的 iPS 細(xì)胞系分化成 β 樣細(xì)胞，并經(jīng) IL1β 處理。這些細(xì)胞更容易發(fā)生細(xì)胞因子誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。對(duì) VDR 作用的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)了互作蛋白 BRD9 和 BRD7。BRD9 與帶 HA 標(biāo)簽的 VDR 和內(nèi)源性 VDR 發(fā)生免疫共沉淀。研究發(fā)現(xiàn)，這種相互作用發(fā)生在 BRD9 溴結(jié)構(gòu)域，且在有 VDR 配體(鈣泊三醇)的情況下減弱。BRD9 拮抗劑 I-BRD9 也會(huì)降低 BRD9 與 VDR 之間的相互作用強(qiáng)度。LC/MS/MS 數(shù)據(jù)以及突變研究均表明，VDR-K91ac 對(duì)與 BRD9 的相互作用很重要。盡管帶 HA 標(biāo)簽的 VDR 與 Flag 標(biāo)簽的 BRD7 結(jié)合，但添加 VDR 配體或 VDR 配體和 I-BRD9 會(huì)增強(qiáng)它們的相互作用。這表明 BRD9 和 BRD7 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合 VDR。根據(jù)先前的研究，PCAF 被列為 VDR-K91ac 乙?；D(zhuǎn)移酶，且與野生型 PCAF 而非 D608A(酶死亡)突變體增加的 VDR-K91ac 相符。破壞與 BRD9 的相互作用，將平衡移向 PBAF 與結(jié)合 BRD7。

糖原合酶激酶 3γ (GSK3γ)

糖原合酶激酶 3γ (GSK3γ) 調(diào)節(jié)糖原合酶，并且近期被證實(shí)參與 OC 骨吸收以及對(duì)前列腺癌細(xì)胞的腫瘤抑制。這種激酶的活性增加還與 2 型糖尿病 (T2D) 有關(guān)。作者發(fā)現(xiàn)，BRD7 蛋白表達(dá)升高會(huì)導(dǎo)致 mTOR 依賴(lài)性模型中的 GSK3b 磷酸化增加(即使在缺乏 AKT1/2 激酶活性的情況下)[PMID：29127434]。(BRD7 過(guò)度表達(dá)同時(shí)阻斷 AKT 和 mTOR 的活性不會(huì)增加 GSK3b 的磷酸化。)BRD7 在缺乏 AKT 活性時(shí)會(huì)調(diào)節(jié) GSK3γ-S9 磷酸化，并啟動(dòng)核糖體蛋白 S6 激酶磷酸化的鏈反應(yīng)，這可導(dǎo)致 4E-BP1 磷酸化增加，從而解除其對(duì) eIF4E 的抑制。在缺乏 AKT 活性且 BRD7 過(guò)度表達(dá)的情況下，4E-BP1 磷酸化較弱。通過(guò)使用肝臟特異性 BRD7 KO 小鼠，作者表明 BRD7 是 mTORC1 保持在與其下互作蛋白上活性所必需的。

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