從微小晶體中解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的新方法

利用X射線揭示蛋白質(zhì)的原子級三維結(jié)構(gòu)，在理解這些分子如何在細(xì)菌、病毒、植物和人類中發(fā)揮作用方面取得了無數(shù)進(jìn)展——并指導(dǎo)了對抗癌癥和艾滋病等疾病的精確藥物的開發(fā)。但是許多蛋白質(zhì)不能長成足夠大的晶體，因?yàn)樗鼈兊脑优帕袝黄谱g。為了應(yīng)對這一挑戰(zhàn)，美國能源部布魯克海文國家實(shí)驗(yàn)室的科學(xué)家和哥倫比亞大學(xué)的同事開發(fā)了一種新方法，從微小的晶體中解決蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。

這種方法依賴于獨(dú)特的樣本處理、信號提取和數(shù)據(jù)組裝方法，以及能夠?qū)?qiáng)X射線聚焦在布魯克海文國家同步輻射光源二號(NSLS二號)——美國能源部科學(xué)辦公室的用戶設(shè)施——上，達(dá)到百萬分之一米的位置，大約是人類頭發(fā)寬度的五十分之一。

布魯克海文實(shí)驗(yàn)室的科學(xué)家劉群說：“我們的技術(shù)確實(shí)打開了處理以前無法接觸到的微晶的大門，包括細(xì)胞表面受體和其他難以結(jié)晶的膜蛋白、柔性蛋白以及許多復(fù)雜的人類蛋白。這項(xiàng)研究的相應(yīng)作者于2019年5月3日發(fā)表在《國際晶體學(xué)聯(lián)合會雜志》上。

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的解釋

自1958年以來，蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)一直是解決蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的主要方法。隨著時(shí)間的推移，隨著X射線源越來越強(qiáng)大，可以進(jìn)行更精確的結(jié)構(gòu)確定。為了確定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，科學(xué)家們測量了像NSLS二號產(chǎn)生的x光是如何衍射或反彈的，以及由同一蛋白質(zhì)分子的許多拷貝組成的有序晶格中的原子是如何以相同的方式排列的。衍射圖案傳達(dá)了原子位置的信息。但這還不夠。

“只有衍射X射線波的振幅會被記錄在探測器上，而不是它們的相位(波之間的時(shí)間)，”劉說。“兩者都需要重建三維結(jié)構(gòu)。這就是所謂的晶相問題。”

晶體學(xué)家通過從不同類型的散射中收集相位數(shù)據(jù)來解決這個(gè)問題，這種散射被稱為異常散射。當(dāng)比蛋白質(zhì)的主要成分碳、氫和氮更重的原子吸收并重新發(fā)射一些X射線時(shí)，就會發(fā)生異常散射。當(dāng)X射線能量接近重原子喜歡吸收的能量時(shí)，就會發(fā)生這種情況。為此，科學(xué)家有時(shí)會在蛋白質(zhì)中人工插入重原子，如硒或鉑。但是整個(gè)蛋白質(zhì)分子中天然存在的硫原子也能產(chǎn)生這樣的信號，盡管它們很弱。雖然這些異常信號很弱，但大晶體通常有足夠的硫原子拷貝，使它們有足夠的硫原子，使它們可以測量。

“一旦知道了硫的位置，就可以計(jì)算出其他蛋白質(zhì)原子的相位，因?yàn)榱蚝推渌拥年P(guān)系是固定的，”劉說。

但是根據(jù)定義，微小的晶體沒有那么多感興趣的蛋白質(zhì)拷貝。因此，布魯克海文/哥倫比亞團(tuán)隊(duì)沒有從單個(gè)大晶體中的蛋白質(zhì)復(fù)制副本中尋找衍射和相位信息，而是從許多微小晶體中開發(fā)了一種測量方法，然后總結(jié)了集體數(shù)據(jù)。

微小的晶體，效果非常好。

為了處理微小的晶體，研究小組開發(fā)了一種帶有微小孔洞的樣品網(wǎng)格。在將含有微晶的溶劑倒入這些安裝好的網(wǎng)格后，科學(xué)家們移除了溶劑，并凍結(jié)了網(wǎng)格上的晶體。

“盡管如此，我們?nèi)匀幻媾R挑戰(zhàn)，因?yàn)槲覀兛床坏轿⑿【w在網(wǎng)格上的位置，”劉說?！盀榱苏业酱鸢?，我們在NSLS-II的前沿微聚焦大分子晶體學(xué)(FMX)光束線上用微衍射測量了整個(gè)網(wǎng)格。一行行掃描，我們就能發(fā)現(xiàn)這些晶體藏在哪里。”

正如FMX的主要光束線科學(xué)家馬丁富克斯解釋的那樣，“FMX光束線可以將X射線束的整個(gè)強(qiáng)度聚焦到1微米或百萬分之一米的大小。我們可以精確地控制光束大小，使其與當(dāng)前實(shí)驗(yàn)中的晶體大小-5微米相匹配。這些能力對于獲得最佳信號至關(guān)重要，”他說。

另一位束線科學(xué)家石五賢指出，“電網(wǎng)測量中收集的數(shù)據(jù)包含了晶體位置的信息。此外，我們還可以看到每個(gè)晶體的衍射，這使得我們只能選擇最佳的晶體數(shù)據(jù)集合?！?

然后，科學(xué)家可以操縱樣品架，將每個(gè)繪制的感興趣的微晶放回精密x光束的中心進(jìn)行數(shù)據(jù)收集。

他們使用光束線上可用的最低能量——盡可能接近硫原子的吸收能量——并收集異常散射數(shù)據(jù)。

哥倫比亞大學(xué)的合著者韋恩亨德里克森說：“大多數(shù)晶體光束線無法到達(dá)優(yōu)化異常信號的硫吸收邊緣。“幸運(yùn)的是，NSLS-II是世界領(lǐng)先的同步加速器光源，提供明亮的X射線并覆蓋廣泛的X射線能量。即使我們的能級略高于硫的理想吸收能，也會產(chǎn)生我們需要的異常信號?！?

但是科學(xué)家們?nèi)匀恍枰鲆恍┕ぷ鱽硖崛∵@些重要的信號，并從許多微小的晶體中收集數(shù)據(jù)。

“我們實(shí)際上獲得了數(shù)千條數(shù)據(jù)，”劉說。“我們使用了大約1400個(gè)微晶，每個(gè)微晶都有自己的數(shù)據(jù)集。我們必須把這些微型

晶的所有數(shù)據(jù)放在一起。”

他們還必須清除受強(qiáng)烈X射線損壞或原子排列略有變化的晶體數(shù)據(jù)。

NSLS-II的結(jié)構(gòu)生物學(xué)項(xiàng)目副光子部門主管兼項(xiàng)目經(jīng)理Sean McSweeney表示，“單個(gè)微晶在被X射線損壞之前不能充分地衍射X射線以獲得結(jié)構(gòu)解決方案。”“對于只有幾微米的晶體，特別是細(xì)菌細(xì)胞的大小，尤其如此。我們需要一種方法來解釋這種損傷和晶體結(jié)構(gòu)的變化，因此不會影響我們的結(jié)果。”

他們通過復(fù)雜的多步驟工作流程完成了這些目標(biāo)，該過程篩選了數(shù)據(jù)，可能由輻射損壞或不相容的晶體引起的丟棄的異常值，并最終提取異常散射信號。

“這是關(guān)鍵的一步，”劉說。“我們開發(fā)了一種計(jì)算程序，以確保只有兼容的數(shù)據(jù)以一種方式合并，以使各個(gè)微晶與衍射圖案對齊。這為我們提供了結(jié)構(gòu)測定所需的信噪比。”

應(yīng)用該技術(shù)

該技術(shù)可用于確定已經(jīng)證明難以結(jié)晶成大尺寸的任何蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。這些包括細(xì)胞表面受體，允許動物和植物等高級生命形態(tài)的細(xì)胞通過釋放激素，傳遞神經(jīng)信號或分泌與細(xì)胞生長和免疫相關(guān)的化合物來感知和響應(yīng)周圍的環(huán)境。

“為了通過進(jìn)化適應(yīng)環(huán)境，這些蛋白質(zhì)具有延展性，并且具有許多不均勻的修飾，”劉說。“很難在水晶中獲得大量的重復(fù)副本，因?yàn)樗鼈儾荒芎芎玫匕b。”

在人類中，受體是藥物的共同目標(biāo)，因此了解其各種結(jié)構(gòu)可以幫助指導(dǎo)新的，更有針對性的藥物的開發(fā)。

但該技術(shù)并不僅限于小晶體。

“我們開發(fā)的方法可以處理小蛋白質(zhì)晶體，但它也可以用于任何大小的蛋白質(zhì)晶體，任何時(shí)候你需要結(jié)合多個(gè)樣品的數(shù)據(jù)，”劉說。