2022年1月17日整理發(fā)布：以天然水凝膠為主要成分的復(fù)合水凝膠

2022年1月17日整理發(fā)布：牙髓再生是近年來牙髓病治療研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。美國牙髓病學(xué)會將牙髓再生定義為“用生物手段，取代受損的牙體組織、牙根、牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體等結(jié)構(gòu)，形成有功能的牙髓樣組織”。牙髓再生的研究主要利用組織工程學(xué)原理和手段，通過異體/自體/歸巢干細(xì)胞-支架-生長因子復(fù)合體誘導(dǎo)分化出牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體，修復(fù)受損牙髓組織并恢復(fù)其生理功能。其中，支架材料發(fā)揮著重要的橋梁作用。

目前，支架材料不僅局限于為細(xì)胞種植、黏附、增殖和空間分布提供三維結(jié)構(gòu)骨架，還起著發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞行為和細(xì)胞內(nèi)信號傳遞，模擬復(fù)原細(xì)胞生活微環(huán)境——細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的作用。水凝膠是在水中可以溶脹的高分子網(wǎng)絡(luò)體系，它由單體經(jīng)過交聯(lián)反應(yīng)形成，在結(jié)構(gòu)和性能上具有不同于其他生物材料的特點(diǎn)。

水凝膠形成的高分子網(wǎng)絡(luò)能夠束縛水分，高含水量使其具有良好的生物相容性。當(dāng)水凝膠置于生物組織中時(shí)，其溶脹性使得水凝膠與組織的邊界趨于模糊，表面張力降低，細(xì)胞和蛋白在其表面黏附減少，因此減少了異物反應(yīng)。水凝膠與周圍組織之間的摩擦力小，可以避免周圍組織受損。水凝膠的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和黏彈性與細(xì)胞外基質(zhì)極為類似，可以模擬細(xì)胞生活的三維微環(huán)境，有利于細(xì)胞增殖和分化。目前水凝膠已用于皮膚、肝臟、血管、軟骨、骨和肌肉組織再生的研究。

在組織工程中，如何使細(xì)胞種植入支架后能在支架中均勻分布，以及如何將支架置入作用部位是其中的關(guān)鍵問題之一，這在牙髓再生中尤為重要。水凝膠可以制備成可注射劑型，在凝膠化前可通過注射的方式使液體充分填充髓腔和根管，然后再發(fā)生凝膠反應(yīng)。這使得水凝膠與周圍組織密切貼合，非常適合在牙髓再生研究中應(yīng)用。

水凝膠包封細(xì)胞后發(fā)生溶膠-凝膠轉(zhuǎn)化，可使細(xì)胞在凝膠內(nèi)部分布較為均勻，可能解決牙髓再生中外源細(xì)胞難以深入根管內(nèi)支架深部的問題。由此可見，水凝膠材料在牙髓組織工程中有著其他材料不可比擬的優(yōu)勢。近年來水凝膠用于牙髓再生受到學(xué)者們關(guān)注，下面按照水凝膠組成分類，將其在牙髓再生領(lǐng)域研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1.天然高分子水凝膠

天然高分子水凝膠材料主要包括膠原/明膠、藻酸鹽、透明質(zhì)酸、殼聚糖、纖維素等。其中，在牙髓再生領(lǐng)域應(yīng)用的主要有膠原基水凝膠、殼聚糖基水凝膠和透明質(zhì)酸基水凝膠。藻酸鹽材料由于其不利于細(xì)胞黏附，較少作為單組分水凝膠用于牙髓再生的研究，常作為復(fù)合水凝膠的材料成分之一，與其他高分子共同發(fā)揮功能。

1.1 膠原基水凝膠

膠原基水凝膠是最廣泛應(yīng)用于牙髓組織工程的水凝膠支架材料。膠原能夠被細(xì)胞識別，并能被細(xì)胞所分泌的蛋白酶降解，因此具有很好的生物學(xué)特性。在一定條件下，膠原分子能自發(fā)形成膠原纖維，并在水性溶劑中形成水凝膠。然而，單一成分的膠原基水凝膠的物理性能不理想，在含水時(shí)難以塑形，無法支撐組織重建。此外，天然膠原常來源于異種生物，因此容易導(dǎo)致免疫反應(yīng)。

近年來出現(xiàn)了安全性較高的人重組膠原支架，它與人體組織內(nèi)的Ⅰ型膠原具有相同的氨基酸序列，明顯減輕了排斥反應(yīng)。Rosa等將脫落乳牙牙髓干細(xì)胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHED) 和人重組膠原水凝膠混合注入發(fā)育完全的人牙根管中，發(fā)現(xiàn)SHED能存活且分化為成牙本質(zhì)樣細(xì)胞。

膠原基水凝膠可制備為可注射水凝膠，如Yuan等制備了以Ⅰ型膠原與Ⅱ型膠原為主要成分的可注射膠原基水凝膠。Suzuki等發(fā)現(xiàn)，結(jié)合趨化因子的Ⅰ型鼠尾膠原基水凝膠也可作為細(xì)胞歸巢的支架，但應(yīng)用時(shí)存在體內(nèi)縮水及降解過快等不足。如何在提高膠原穩(wěn)定性的同時(shí)保持膠原活性，是今后膠原基水凝膠材料需要解決的難題。

1.2 透明質(zhì)酸基水凝膠

透明質(zhì)酸是一種構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白多糖，其共價(jià)交聯(lián)形成的水凝膠具有良好的生物相容性。在透明質(zhì)酸基水凝膠中添加基質(zhì)金屬蛋白酶的酶切位點(diǎn)，使其具有了良好的降解性能。但單一成分的透明質(zhì)酸基水凝膠的機(jī)械性能較差，需要通過復(fù)合其他組分或化學(xué)修飾以改善性能。2009年，有學(xué)者研發(fā)了酪胺化的透明質(zhì)酸基水凝膠CorgelTM。這種水凝膠在添加過氧化氫引發(fā)劑后發(fā)生凝膠化，并且能在一定程度上抵抗透明質(zhì)酸酶消化，維持相對穩(wěn)定性。

Lambricht等比較了2種海藻酸鹽基水凝膠和CorgelTM對根尖牙乳頭干細(xì)胞(stem cell from apical papilla，SCAP)的影響，發(fā)現(xiàn)SCAP在這種透明質(zhì)酸基水凝膠中能夠維持增殖活性和向成牙本質(zhì)樣細(xì)胞分化。另一種商品化透明質(zhì)酸基水凝膠RestylaneTM含有甘油醚交聯(lián)劑(butanediol diglycidyl ether，BDDE)，目前作為填充劑已廣泛應(yīng)用于醫(yī)療美容，與人體相容性好， 具有原位可注射性且可吸收。Chrepa等發(fā)現(xiàn)，RestylaneTM作為支架材料在體外能促進(jìn)人牙髓干細(xì)胞(dental pulp stem cells，DPSCs) 成牙本質(zhì)向分化。目前未見其應(yīng)用于動物體內(nèi)牙髓再生的研究報(bào)道。

1.3 殼聚糖基水凝膠

殼聚糖是天然多糖甲殼素的脫乙酰產(chǎn)物，可以通過物理締合(如結(jié)合陰離子、聚電解質(zhì)、添加聚合物等) 或交聯(lián)(化學(xué)交聯(lián)、互穿網(wǎng)絡(luò)) 形成殼聚糖基水凝膠，并可以精確地獲得需要的孔徑大小、交聯(lián)程度和溶解度。殼聚糖基水凝膠由于其良好的生物相容性、生物降解性和天然抗菌作用，還可作為多種藥物的緩釋/控釋載體，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了深入的研究和應(yīng)用。

研究顯示，殼聚糖基水凝膠構(gòu)成的地塞米松釋放系統(tǒng)可以調(diào)節(jié)藥物釋放的速率，不同程度地促進(jìn)SCAP的增殖和分化。在牙髓組織工程中，Park等研發(fā)了殼聚糖基的熱響應(yīng)型水凝膠，體外研究顯示這種水凝膠聯(lián)合使用釉質(zhì)基質(zhì)衍生物能夠促進(jìn)DPSCs的增殖和分化。多項(xiàng)研究均表明，殼聚糖對于牙源性干細(xì)胞的增殖和分化有良好的促進(jìn)作用。殼聚糖基水凝膠可通過改性實(shí)現(xiàn)在體內(nèi)的可注射性和原位凝膠化，具有可注射型支架的應(yīng)用前景。但是，單一組分的殼聚糖基水凝膠也有與其他天然高分子水凝膠相似的弱點(diǎn)，即機(jī)械強(qiáng)度差。此外，殼聚糖在體內(nèi)的降解機(jī)制尚未明確，體內(nèi)降解過程較難調(diào)控。

1.4 纖維素基水凝膠

纖維素的納米晶體(cellulose nanocrystals，CNC)因其具備一定的剛性和機(jī)械強(qiáng)度，常作為復(fù)合水凝膠中的填料摻入水凝膠網(wǎng)絡(luò)中。但是，它們“纏結(jié)”的能力有限，不適用于構(gòu)建單組分凝膠。纖維素納米原纖維(cellulose nanofibrils，CNF) 具有更好的柔韌性和纏結(jié)傾向，更易形成水凝膠。

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，CNF水凝膠作為細(xì)胞培養(yǎng)支架具有細(xì)胞毒性小且能誘導(dǎo)細(xì)胞球狀體形成的優(yōu)點(diǎn)。然而，單一成分的纖維素基水凝膠機(jī)械性能相對較弱，且缺乏宏觀結(jié)構(gòu)或?qū)哟谓Y(jié)構(gòu)，限制了其作為仿生水凝膠的進(jìn)一步應(yīng)用。目前尚無纖維素單組份水凝膠用于牙髓再生的研究報(bào)道。體外研究發(fā)現(xiàn)，DPSCs在羧甲基纖維素-羥磷灰石水凝膠中具有良好的成骨向分化和成牙向分化能力。

1.5 藻酸鹽基水凝膠

藻酸鹽基水凝膠作為1種天然的生物材料，具有良好的生物相容性并且易于凝膠化，在傷口愈合、載藥和組織工程中廣泛應(yīng)用。由于缺乏哺乳動物細(xì)胞黏附受體和對蛋白質(zhì)的低吸附性，藻酸鹽基水凝膠可以作為一個(gè)理想的“空白支架”，允許多種方式修飾，從而改善其性能。在精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)黏附配體修飾的藻酸鹽溶液中，細(xì)胞可以形成均勻的分散體。該體系通過特定的受體-配體相互作用生成交聯(lián)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，無需使用任何其他的交聯(lián)分子。

有研究發(fā)現(xiàn)，與未添加黏附配體的藻酸鹽基水凝膠相比，RGD-藻酸鹽基水凝膠使細(xì)胞黏附和增殖能力顯著增強(qiáng)。在牙髓再生方面，RGD-藻酸鹽基水凝膠包載了血管內(nèi)皮生長因子和成纖維生長因子后，能促進(jìn)DPSCs/人臍靜脈上皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs) 的黏附、增殖和分化。但是，藻酸鹽的純度差異可能會引起細(xì)胞的免疫反應(yīng)，目前仍需要更加標(biāo)準(zhǔn)化的方法去除藻酸鹽中的雜質(zhì)成分。

2.發(fā)展中的合成高分子水凝膠

合成高分子水凝膠通常具有規(guī)則的結(jié)構(gòu)，并且可設(shè)計(jì)修飾某些功能基團(tuán)，從而實(shí)現(xiàn)功能調(diào)控。在組織工程中研究較多的聚合物主要有聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)、聚乙醇酸(polyglycolide acid，PGA)、聚乳酸(polylactic acid，PLA)、聚己酸內(nèi)酯(polycaprolactone，PCL)和多肽聚合物等。

除多肽聚合物外，其余聚合物均為惰性材料，無生物活性，且其降解產(chǎn)物多為酸性，從而造成局部環(huán)境的改變，難以作為單一成分的水凝膠支架用于牙髓組織工程。因此，這些惰性聚合物多與明膠/膠原/殼聚糖等交聯(lián)形成復(fù)合水凝膠用于牙髓再生的研究。Galler等將可注射PEG-纖維蛋白水凝膠用于牙髓再生的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究，獲得了血管化的類牙髓樣結(jié)締組織。

目前，由多肽聚合物在低濃度溶液中自組裝成的具有纖維結(jié)構(gòu)的多肽(self-assembling peptide，SAP) 水凝膠已成為研究熱點(diǎn)之一。在組織工程應(yīng)用中，SAP水凝膠具有良好生物相容性和可降解性，能構(gòu)建納米級支架和緩釋系統(tǒng)，可設(shè)計(jì)功能性的氨基酸序列以滿足不同類型細(xì)胞的生長需要。改變多肽濃度能使水凝膠的硬度和粘度發(fā)生變化，從而改變水凝膠的可塑性。

Puramatrix水凝膠是一種商品化的可注射型SAP水凝膠。Dissanayaka等用PuraMatrix同時(shí)包載HUVECs和DPSCs進(jìn)行動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，觀察到形成了豐富的血管網(wǎng)。但是SAP水凝膠的制備工藝復(fù)雜，成本較高，獲取途徑有限，這對SAP水凝膠的推廣應(yīng)用有一定的限制。

3.以天然水凝膠為主要成分的復(fù)合水凝膠

天然水凝膠能維持較高的細(xì)胞存活率，而合成水凝膠能更好地控制其物理和機(jī)械性質(zhì)，不同凝膠組分在交聯(lián)過程中形成的互穿網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)也會改變凝膠的理化性能。因此，以天然水凝膠為主要成分的復(fù)合水凝膠逐漸成為研究趨勢。復(fù)合水凝膠有2種形式：共聚物水凝膠和互穿網(wǎng)絡(luò)聚合物(interpenetrating polymer network，IPN) 水凝膠。共聚物水凝膠是由兩種或多種不同的單體沿著聚合物網(wǎng)絡(luò)的鏈以不規(guī)則、嵌段或交替構(gòu)型排列形成，而IPN水凝膠是由兩種合成和/或天然聚合物成分分別獨(dú)立交聯(lián)形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

研究報(bào)道，藻酸鹽與膠原復(fù)合水凝膠的機(jī)械性能增強(qiáng)，且能維持較好的生物相容性和細(xì)胞均勻分布特性。藻酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.5%~1%范圍內(nèi)能使復(fù)合水凝膠具有較好的彈性模量和適宜的剛性，使得DPSCs能在生長因子誘導(dǎo)下增殖和分化。Ravindran等發(fā)現(xiàn)ECM-膠原-殼聚糖復(fù)合支架可以誘導(dǎo)DPSCs向成牙本質(zhì)方向分化，并在動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中觀察到血管形成。

目前，可注射的復(fù)合水凝膠在牙髓組織工程中具有良好的應(yīng)用前景?？勺⑸涞募谆┧狨ッ髂z(gelatin methacryloyl，GelMA) 水凝膠用于DPSCs/HUVECs的培養(yǎng)，可促進(jìn)細(xì)胞的黏附和增殖，同時(shí)促進(jìn)血管的新生。研究顯示，由聚乙二醇二丙烯酸酯-透明質(zhì)酸-明膠合成的可注射復(fù)合水凝膠HyStem-C對DPSCs具有良好的相容性，DPSCs可在其中遷移、生存和增殖。但是在牙髓組織工程中，目前僅有少量特定組分的復(fù)合水凝膠進(jìn)行了體外或動物體內(nèi)研究，尚無臨床研究報(bào)告。

此外，尚缺乏不同復(fù)合水凝膠應(yīng)用于牙髓組織再生的對比研究。綜上所述，在牙髓再生研究領(lǐng)域中，理想的水凝膠支架材料不僅應(yīng)具有優(yōu)異的生物學(xué)性能，可以模擬ECM，參與釋放信號分子，調(diào)控干細(xì)胞的行為，還應(yīng)具有優(yōu)良的理化性能，包括適宜的強(qiáng)度、合適的孔隙率、與組織新生速率相匹配的降解速率，以及可原位注射適應(yīng)根管形態(tài)的特性。從成分上來說，膠原、殼聚糖和透明質(zhì)酸是經(jīng)典且具有良好生物學(xué)特性的凝膠組分，多肽水凝膠目前處于前沿研究熱點(diǎn)。

牙髓再生支架研究應(yīng)進(jìn)一步在不同組分、性質(zhì)和功能的水凝膠中篩選具備根管內(nèi)應(yīng)用特性，即可注射且在溫和條件下原位成形的支架材料。然而，如何借助支架材料的發(fā)展，完成從實(shí)驗(yàn)室到臨床的轉(zhuǎn)化，實(shí)現(xiàn)真正的牙髓再生，仍需要進(jìn)一步的探索。

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