從微量樣品中解碼生物分子的身份是生物技術(shù)領(lǐng)域的一個(gè)長(zhǎng)期目標(biāo)，雖然下一代測(cè)序技術(shù)已經(jīng)可以識(shí)別單個(gè)DNA和RNA分子，但同樣的功能尚無(wú)法用于蛋白質(zhì)。但哈佛大學(xué)維斯研究所、哈佛醫(yī)學(xué)院布拉瓦尼克研究所(HMS)和波士頓兒童醫(yī)院(BCH)分子機(jī)器人計(jì)劃的科學(xué)家們現(xiàn)在已經(jīng)利用DNA創(chuàng)造了他們所說(shuō)的世界上最小的統(tǒng)治者。測(cè)量蛋白質(zhì)。
該技術(shù)被稱為“DNA納米開(kāi)關(guān)卡尺”(DNC)，使研究人員能夠通過(guò)施加少量的力對(duì)單個(gè)肽進(jìn)行高精度距離測(cè)量。通過(guò)對(duì)同一分子快速進(jìn)行多次距離測(cè)量，DNC創(chuàng)建了一個(gè)獨(dú)特的“指紋”，可用于在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中識(shí)別同一分子。
“當(dāng)你試圖理解生物學(xué)中的某些東西時(shí)，有兩種主要的探究方法：你可以觀察自然狀態(tài)下的研究對(duì)象，或者你可以擾亂它并觀察它的反應(yīng)，”助理研究員韋斯利·黃博士說(shuō)Wyss研究所的教員和HMS的副教授，同時(shí)也是BCH的研究員。“觀察可以提供大量重要的生物信息，但有時(shí)了解某些事物的最佳方法是與其進(jìn)行身體互動(dòng)。通過(guò)施加力來(lái)確定肽分子內(nèi)氨基酸的模式是正在進(jìn)行的科學(xué)探索中的一個(gè)新范例，這些技術(shù)將使我們能夠像目前對(duì)DNA進(jìn)行測(cè)序一樣輕松地對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行測(cè)序。”
Wong是該團(tuán)隊(duì)在《自然納米技術(shù)》上發(fā)表的論文的通訊作者，論文題為“使用DNA納米開(kāi)關(guān)卡尺進(jìn)行單分子機(jī)械指紋識(shí)別”。
蛋白質(zhì)在幾乎所有生物過(guò)程中都發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，但這些分子比DNA和RNA復(fù)雜得多，并且經(jīng)常經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾，這使得樣品中單個(gè)蛋白質(zhì)(單分子蛋白質(zhì)組學(xué))的識(shí)別具有挑戰(zhàn)性。作者寫道：“DNA分析的進(jìn)步極大地影響了臨床實(shí)踐和基礎(chǔ)研究，但蛋白質(zhì)的相應(yīng)發(fā)展由于其相對(duì)復(fù)雜性和我們無(wú)法放大它們而面臨挑戰(zhàn)。”“一種準(zhǔn)確、全面分析痕量樣品中蛋白質(zhì)的方法將影響從診斷到細(xì)胞生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，但仍然是一個(gè)極具挑戰(zhàn)性的目標(biāo)......盡管質(zhì)譜法和質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)等方法取得了進(jìn)展，但單分子蛋白質(zhì)鑒定仍然是一個(gè)極具挑戰(zhàn)性的目標(biāo)客觀的。”
DNC基于DNA納米開(kāi)關(guān)的底層技術(shù)。實(shí)際上，這是一條單鏈DNA，在其長(zhǎng)度上的多個(gè)點(diǎn)上附有分子“手柄”。當(dāng)其中兩個(gè)手柄相互結(jié)合時(shí)，它們會(huì)在DNA鏈中形成一個(gè)環(huán)，并且鏈的總長(zhǎng)度會(huì)縮短。當(dāng)用力將手柄拉開(kāi)時(shí)，線繩會(huì)延伸回其原始長(zhǎng)度。處于環(huán)狀和非環(huán)狀狀態(tài)的線的長(zhǎng)度之間的差異反映了環(huán)的尺寸，從而反映了手柄之間的距離。
研究小組意識(shí)到他們可以將DNA納米開(kāi)關(guān)更進(jìn)一步。如果他們將手柄設(shè)計(jì)為與生物分子結(jié)合，那么手柄可以像卡尺的兩個(gè)尖端一樣有效地在它們之間“夾住”分子，而不是相互結(jié)合。通過(guò)測(cè)量在手柄之間添加目標(biāo)分子如何改變DNA納米開(kāi)關(guān)在環(huán)狀和非環(huán)狀狀態(tài)下的總長(zhǎng)度，研究小組假設(shè)他們可以有效地測(cè)量分子的大小。
“在某些方面，DNA納米開(kāi)關(guān)利用了一種最經(jīng)典的機(jī)械方法來(lái)測(cè)量物體：只需對(duì)某物施加力，然后觀察它的反應(yīng)如何變化，”共同第一作者、Wyss博士后研究員DarrenYang博士說(shuō)。研究所和BCH。“我們還沒(méi)有真正看到這種方法用于單分子蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域，因?yàn)閷?duì)如此小的物體施加力是非常具有挑戰(zhàn)性的。但我們迎接了挑戰(zhàn)。”
為了將他們的基于力的新測(cè)量技術(shù)的想法變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)，Yang和同事首先將兩種不同類型的手柄連接到目標(biāo)分子：一個(gè)“強(qiáng)”手柄將分子牢固地錨定在DNC的一端，以及多個(gè)手柄。可以連接到DNC另一端的“弱”手柄。然后，他們將DNC的兩端拴在兩個(gè)懸浮在激光束中的光學(xué)捕獲珠上。通過(guò)將珠子移得更近，他們誘導(dǎo)目標(biāo)分子的弱手柄之一與DNC結(jié)合，形成環(huán)狀狀態(tài)。然后，當(dāng)他們通過(guò)將珠子進(jìn)一步移開(kāi)來(lái)增加力量時(shí)，弱手柄最終釋放了其鍵合??，使DNC恢復(fù)到更長(zhǎng)的、未成環(huán)的狀態(tài)。”
“DNA納米開(kāi)關(guān)是在特定位點(diǎn)裝飾的DNA系鏈，其功能可以直接相互結(jié)合或通過(guò)第三個(gè)橋接復(fù)合物結(jié)合，”作者解釋道。“結(jié)合導(dǎo)致納米開(kāi)關(guān)的一部分環(huán)出，縮短了系鏈長(zhǎng)度;當(dāng)這些鍵斷裂時(shí)，系鏈會(huì)延伸回原來(lái)的長(zhǎng)度……本質(zhì)上，從環(huán)狀結(jié)構(gòu)到非環(huán)狀結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)度變化反映了閉合環(huán)的分子橋的大小——橋越大，長(zhǎng)度變化越小”。
該團(tuán)隊(duì)首先在簡(jiǎn)單的單鏈DNA(ssDNA)分子上測(cè)試了DNC技術(shù)，并證實(shí)DNC的環(huán)狀和非環(huán)狀狀態(tài)之間的距離測(cè)量變化與目標(biāo)分子的長(zhǎng)度直接相關(guān)。這些長(zhǎng)度變化可以以埃級(jí)精度(比DNA雙螺旋寬度小十倍)進(jìn)行測(cè)量，從而能夠識(shí)別與單個(gè)核苷酸一樣小的長(zhǎng)度變化。
由于目標(biāo)分子包含多個(gè)可以與DNC結(jié)合的弱手柄，因此結(jié)合和破壞這些手柄的重復(fù)循環(huán)會(huì)在強(qiáng)手柄和弱手柄之間產(chǎn)生一系列距離測(cè)量值，這些距離測(cè)量值對(duì)于每個(gè)測(cè)量的分子來(lái)說(shuō)是唯一的。這種“指紋”可用于識(shí)別樣品中的已知分子，或推斷未知分子的結(jié)構(gòu)信息。
在確認(rèn)DNC可以可靠地測(cè)量DNA分子的大小后，研究人員將注意力轉(zhuǎn)向蛋白質(zhì)。他們?cè)O(shè)計(jì)了一種已知長(zhǎng)度和序列的合成肽，并重復(fù)實(shí)驗(yàn)，通過(guò)強(qiáng)手柄將其連接到DNC的一端，并通過(guò)施加不同大小的力反復(fù)連接和破壞其弱手柄和DNC之間的鍵。
他們發(fā)現(xiàn)，他們的工具測(cè)量的強(qiáng)手柄和弱手柄之間的所有距離都與根據(jù)DNC長(zhǎng)度和肽中氨基酸長(zhǎng)度預(yù)期的距離相匹配。當(dāng)他們使用DNC測(cè)量天然存在的線性化肽NOXABH3時(shí)，也得到了類似的結(jié)果。
該過(guò)程還為每種肽生成了獨(dú)特的測(cè)量指紋。“對(duì)單個(gè)分子進(jìn)行多次距離測(cè)量可以創(chuàng)建可用于蛋白質(zhì)識(shí)別的機(jī)械指紋……”他們寫道。該團(tuán)隊(duì)創(chuàng)建了一個(gè)計(jì)算機(jī)模型來(lái)預(yù)測(cè)使用這種方法可以唯一識(shí)別多少人類蛋白質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)常用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中超過(guò)75%的蛋白質(zhì)可以通過(guò)指紋識(shí)別，概率至少為90%。
“實(shí)際上，我們對(duì)這項(xiàng)技術(shù)的效果感到有些驚訝，”共同第一作者、Wyss研究所和BCH的博士后研究員PrakashShrestha博士說(shuō)。“光鑷已經(jīng)存在了幾十年，而在環(huán)狀和非環(huán)狀狀態(tài)之間循環(huán)DNA也已經(jīng)存在了大約10年，我們不確定是否可以通過(guò)結(jié)合這些想法來(lái)獲得足夠高分辨率的測(cè)量。但事實(shí)證明，這些指紋對(duì)于識(shí)別蛋白質(zhì)非常有效。”
識(shí)別單個(gè)蛋白質(zhì)分子本身就是一項(xiàng)令人印象深刻的壯舉，但能夠同時(shí)識(shí)別多個(gè)蛋白質(zhì)才是單分子蛋白質(zhì)組學(xué)的真正圣杯。該團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步證明，通過(guò)用磁鑷系統(tǒng)替換光珠，他們能夠并行測(cè)量多種不同的肽，并確定不同分子的相對(duì)濃度。他們寫道：“使用光鑷，我們展示了對(duì)DNA和肽的埃級(jí)精度的絕對(duì)距離測(cè)量，并使用多重磁性鑷子，我們展示了混合樣品中相對(duì)豐度的量化。”
“我們還展示了如何通過(guò)在多路磁鑷系統(tǒng)上實(shí)施該測(cè)定來(lái)通過(guò)并行化來(lái)提高通量。這使我們能夠測(cè)量異質(zhì)混合物中不同比例的肽的相對(duì)濃度。”
共同通訊作者WilliamShih博士是Wyss研究所的核心教員，同時(shí)也是HMS和Dana-Farber癌癥研究所的教授，他進(jìn)一步評(píng)論道：“由于規(guī)模化和分辨率方面的挑戰(zhàn)，單分子蛋白質(zhì)組學(xué)在很大程度上仍然是一個(gè)白日夢(mèng)。。我們目前的工作表明，基于力的序列指紋識(shí)別有潛力實(shí)現(xiàn)這一夢(mèng)想。我們的最終目標(biāo)不僅是高效讀取蛋白質(zhì)序列，還以高通量方式有效讀取蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。”
科學(xué)家們實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的下一步是驗(yàn)證他們的卡尺對(duì)折疊蛋白質(zhì)及其復(fù)合物的低力結(jié)構(gòu)測(cè)量，研究它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)生物學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)中的潛在用途。他們寫道：“DNC有可能用于測(cè)量蛋白質(zhì)折疊結(jié)構(gòu)中多個(gè)殘基之間的距離，這將能夠表征生物分子和生物分子復(fù)合物的動(dòng)態(tài)3D結(jié)構(gòu)，補(bǔ)充現(xiàn)有的結(jié)構(gòu)闡明生物物理方法。”
該團(tuán)隊(duì)還致力于提高該技術(shù)的吞吐量，以進(jìn)一步加快混合樣品的分析速度。“DNC還可以集成到其他力譜方法中，以納入額外的功能或提高動(dòng)態(tài)范圍、空間精度或吞吐量，”他們建議。“DNC提供了一種強(qiáng)大的方法來(lái)表征納米級(jí)復(fù)合物內(nèi)的距離和幾何形狀，有可能影響從蛋白質(zhì)組學(xué)和納米技術(shù)到結(jié)構(gòu)生物學(xué)和藥物發(fā)現(xiàn)的廣泛領(lǐng)域。”
“這項(xiàng)研究將分子生物物理學(xué)與Wyss研究所首創(chuàng)的尖端DNA納米技術(shù)相結(jié)合，使我們能夠以一種真正新穎的方式與生物分子相互作用并進(jìn)行分析，”Wyss創(chuàng)始人、醫(yī)學(xué)博士、哲學(xué)博士DonIngber說(shuō)道。JudahFolkman是哈佛醫(yī)學(xué)院和BCH血管生物學(xué)教授，也是哈佛大學(xué)約翰·A·保爾森工程與應(yīng)用科學(xué)學(xué)院生物工程教授。“當(dāng)威廉和韋斯利第一次將這個(gè)想法作為新成立的分子機(jī)器人計(jì)劃的核心挑戰(zhàn)時(shí)，它確實(shí)看起來(lái)像是科幻小說(shuō)，但這正是我們想要在Wyss開(kāi)展的項(xiàng)目類型。我為團(tuán)隊(duì)使這項(xiàng)技術(shù)成為現(xiàn)實(shí)感到非常自豪——它有可能徹底改變我們進(jìn)行科學(xué)研究和開(kāi)發(fā)治療方法的方式。”
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