打開Cas9 更好地控制CRISPR基因編輯

CRISPR-Cas9是一個革命性的工具，部分原因是它的多功能性：一種由細菌產(chǎn)生的咀嚼病毒，它還能在人類細胞中有效地執(zhí)行各種遺傳技術(shù)，包括切割和粘貼DNA、進行精確的突變以及激活或失活基因。

加州大學伯克利分校的研究人員現(xiàn)在通過提供一個“開”開關使它更加通用，允許用戶在除指定目標之外的所有細胞中保持Cas9基因編輯器關閉。

重新設計的Cas9酶——研究人員稱之為procas9含有一定長度的蛋白質(zhì)，需要在酶結(jié)合并切割DNA之前進行切割。如果科學家插入一小塊蛋白質(zhì)，這種蛋白質(zhì)只能被特定的酶切割，例如癌細胞或傳染性病毒或細菌的特殊酶，那么這種酶將成為打開Cas9的觸發(fā)器。

ProCas9基本上“感知”其所在的細胞類型，這是基于蛋白質(zhì)裂解酶(一種所謂的蛋白酶)的存在。

加州大學伯克利分校分子細胞生物學副教授大衛(wèi)薩維奇說：“這是一個額外的安全層，可以放在分子上，以確保精確切割?！?

除了可編程輸出，它還給出了Cas9蛋白的可編程輸入。

薩維奇說：“有許多蛋白酶調(diào)節(jié)細胞中的信號通路，將正常細胞轉(zhuǎn)化為癌細胞，并參與病原體感染?！叭绻覀兡芨兄竭@些信號，我們就能利用這些重要的方式，做出相應的反應。”

在這項研究中，Savage和他的同事通過使Cas9對植物和人類病毒如西尼羅河病毒敏感，證明了Cas9的蛋白酶控制。未來，他們相信這項技術(shù)可以用于將CRISPR-Cas9細菌免疫系統(tǒng)引入植物，幫助它們抵抗有害的病毒病原體。

來自加州大學伯克利分校和舊金山格拉德斯通研究所的研究人員的這項研究將于1月10日在線發(fā)表在《細胞》雜志上。

剝?nèi)as9的必需品

Savage最初的研究目標是通過切斷DNA來削減Cas9蛋白——實際上是基因編輯的“剪刀”——最簡單的部分，以獲得最強大的基因編輯器。越簡單，越容易使用和運輸?shù)郊毎?

他說：“我們知道Cas蛋白是復雜的，它們具有各種調(diào)節(jié)功能，這對于它們在細菌免疫系統(tǒng)中的功能非常重要。“我們工作的主要目標是馴服它們供人類使用，并去除與基因組編輯無關的不必要的東西?！?

特別是，他想重新設計Cas9，使其更容易附著其他蛋白質(zhì)。這將允許Cas9攜帶具有多種功能的蛋白質(zhì)到DNA的正確位置。這些被稱為融合蛋白，它們有前途的變體可以改變基因表達，或者在稱為堿基編輯的技術(shù)的情況下，精確地改變脫氧核糖核酸中的堿基或核苷酸。

他用來重新設計Cas9的技術(shù)被稱為圓形排列，他從未嘗試過像Cas9這樣復雜的蛋白質(zhì)。環(huán)形排列包括獲得Cas9蛋白的氨基酸串并切割它，切換兩個片段的順序，然后允許它折疊成新的3D構(gòu)型。他這樣做是為了把蛋白質(zhì)分成兩部分。

雖然你可能認為這將徹底破壞蛋白質(zhì)，但在大約10%的情況下，New protein仍然有效，就像他只是以不同的方式重新排列了蛋白質(zhì)的亞基，而不影響它們的功能一樣。這可能是有效的，因為正如CRISPR-Cas9的發(fā)明者Jennifer Doudna和她的同事們所展示的，Cas9蛋白復合物具有高度的靈活性，當它抓住引導RNA時，就會移動，與dna結(jié)合，移動到切割DNA鏈的位置。

薩維奇目前正在探索一些Cas9重排，這可能為融合蛋白提供更好的支架，使它們更接近目標DNA鏈。

在重新排列Cas9支架的過程中，他偶然發(fā)現(xiàn)自己以不同的方式重新連接了兩個蛋白質(zhì)片段。

他說：“當我們切割蛋白質(zhì)并將舊片段移動到蛋白質(zhì)中的新位置時，系統(tǒng)對兩個片段連接在一起的方式變得非常敏感?！拔覀円庾R到，我們可以利用這種敏感性來設計蛋白質(zhì)，以獲得蛋白酶識別位點?！?

他說，研究表明“我們不堅持蛋白質(zhì)，這是大自然賦予我們的基因組編輯器”。“這些蛋白質(zhì)可以經(jīng)過精心優(yōu)化，成為自然界中沒有的支架，但它們具有適合人類細胞的特性?！?

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