導讀 DMD 是一種嚴重的肌肉退化性疾病，由導致肌營養(yǎng)不良蛋白基因移碼的基因組突變引起。外顯子跳躍是一種很有前途的恢復肌營養(yǎng)不良蛋白的方法...
DMD 是一種嚴重的肌肉退化性疾病，由導致肌營養(yǎng)不良蛋白基因移碼的基因組突變引起。外顯子跳躍是一種很有前途的恢復肌營養(yǎng)不良蛋白的方法，而 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)則作為一種新興方法出現。
然而，誘導大缺失以覆蓋分布在數百個堿基上的目標外顯子的技術有限。
關于該研究
本研究評估了 CRISPR-Cas3 系統(tǒng)作為 DMD 患者的基因組編輯工具。
針對 Cas3 開發(fā)了基于雙色單鏈退火 (SSA) 的報告系統(tǒng)，以增強基因編輯的細胞，然后進行距離分析。
Cas3-CRISPR RNA (crRNA) 的多重作用導致了基因組 MES。研究了在 DMD 誘導的多能干細胞中誘導 MES 的最佳 crRNA 配對，并設計了一種富集基因組編輯細胞的報告方法。
為了研究脫靶誘變的可能性，對基因編輯的克隆進行了全基因組測序 (WGS)，然后研究了與潛在 CRISPR RNA 結合區(qū)域相關的缺失。
一對向內夾著目標基因組區(qū)域的 crRNA 用于分析。使用適用于雙 Cas3 的 SSA 報告載體系統(tǒng)豐富了雙 Cas3 方法。
研究小組還在人胚腎 (HEK)293T 細胞中測試了間隔為 344 kb 的內向雙 Cas3 誘導的缺失模式。插入包含 CRISPR RNA 檢測區(qū)域的長間隔區(qū)(0.5 至 1.7 kb)的序列，以將目標基因序列延伸至 Cas3 缺失。
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